单细胞多组学揭示了驱动肺纤维化的内皮细胞机械敏感性 PIEZO1-IL-33 轴

肺纤维化（PF）是一系列慢性、进行性、间质性肺疾病，其特征是细胞外基质过度沉积，最终导致显著的发病率和死亡率，特发性肺纤维化（IPF）是最常见且临床意义最强的亚型。当前研究暗示了 PF 发病中的修复机制失调，特别是以纤维化细胞外基质逐渐积累为特征的异常伤口愈合反应。这一复杂过程涉及肺部结构细胞（上皮细胞、内皮细胞）与募集的效应细胞（免疫群体、激活的成纤维细胞）之间的协调相互作用，通过一个不断演化的可溶介质网络（如细胞因子、趋化因子）调节细胞间通讯。新出现的证据表明，肺成纤维细胞和血管细胞之间存在空间邻接，细胞间通讯失调推动了纤维化重塑的进展，其强调了肺部内皮细胞（EC）衍生的分子通路是 PF 干预的新治疗靶点。

ECs 利用机械传感器通过称为机械转导的过程来传导机械刺激。这一生物机制将机械力（如剪切应力、循环拉伸）转化为细胞内生化信号，从而诱导染色质重塑和转录重编程。生物力学应力协调了涵盖血管生成、细胞凋亡调控、炎症反应和血管活性介质产生、与生理适应和病理进展相关的失调等关键内皮功能。细胞外基质（ECM）传递的细胞牵引力形成相互机械反馈，ECM 硬度扰乱机械敏感信号级联反应，最终损害疾病状态下的 EC 功能可塑性。病理性 ECM 积累—纤维化重塑的标志—很可能在肺泡形态发生过程中破坏机械稳态，从而改变肺血管机械生物学。然而，异常机械信号与肺血管功能障碍之间的精确分子机制仍未完全确定。

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牵张应变细胞培养仪

鉴于此，四川大学华西医院高原医学中心、广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室、深圳湾实验室化学生物学研究所等研究团队通过对 IPF 患者肺组织进行单核 RNA 测序（snRNA-seq）分析，发现了与纤维化进展相关的ECs中的机械敏感转录特征；多组学分析展示了肺血管内 PIEZO1 机械转导通路的病理性上调；机制研究也显示，PIEZO1 的活化通过 CAPN2/STAT3 介导的转录激活诱导内皮 IL33 分泌，确立了该机械化学轴作为成纤维细胞激活的驱动因子。这些发现确立了通过 PIEZO1-IL33 信号的内皮机械转导作为肺纤维化干预的药物靶点。研究成果发表于 Nature Communications 顶刊题为“Single-cell multiomics uncovers an endothelial mechanosensitive PIEZO1-IL-33 axis driving pulmonary fibrosis”。

首先，收集四名特发性肺纤维化（IPF）肺移植者及五名非IPF正常对照组的肺组织，进行单核RNA测序（snRNA-seq），并从IPF患者和正常对照组获取细胞研究了15个细胞亚群。特发性肺纤维化的主要指标是用力肺活量（FVC）下降，鉴于FVC ≤ 50% 预示着严重肺功能障碍和显著生理损害，因此确定FVC的50% 作为诊断阈值。受试者被分为两种表型：FVC ≤ 50% 者为FVC-低表型（FLP），FVC > 50% 者为FVC-高表型（FHP），数据分析表明，FLP ECs在整体细胞群中比例最高。界定与肺纤维化进展期间严重肺功能障碍相关的ECs中的异常信号通路，基因集评分显示，IPF组机械应力（MS）信号通路显著上调。

为进一步验证上述发现，研究人员扩大了样本量，分析显示，ECs的机械应力评分与样本纤维化评分呈正相关。此外，还关注了机械应力是否导致IPF的进展，发现IPF患者肺细胞中机械应力普遍增加。GEO数据集的荟萃分析验证了IPF患者的ECs表现出相对较高的机械应力，且机械应力评分与总成纤维细胞中肌成纤维成细胞的百分比及成纤维细胞标志物之间呈正相关。这些结果表明，ECs中异常升高的机械应力与PF的发生有关。

硅肺病是因吸入大量二氧化硅（SiO₂）粉尘而引起的职业性PF的一种。为了确定PF中的ECs是否表现出机械应力升高，通过气管灌注SiO₂ 建立了硅肺小鼠模型，H&E和Masson染色结果显示，PF小鼠模型中SiO₂诱导显著的间质性肺纤维化（图1 A、B）。

经SiO₂处理和生理盐水处理小鼠的质量评估和筛选，scRNA测序将39048个细胞聚集在一起，并根据标记基因表达识别出肺组织中的主要细胞类型，UMAP图显示了肺细胞亚群，包括内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞（SMC）和成纤维细胞等（图1 C）。此外，还使用R软件包“Seurat”分析了包含26575个细胞的scATAC-seq数据集预测细胞类型（图1 D）。通过scATAC-seq和scRNA-seq在小鼠肺组织中鉴定了SiO₂处理后的细胞亚型标志物（图1 E-F）。为研究ECs中差异调控的信号通路，对scRNA-seq数据集的ECs进行了Go分析和MS评分，发现SiO₂处理小鼠的ECs显示出升高的机械转导信号（图1 G-I）。还分析了 SiO₂ 处理和生理盐水处理小鼠的 scATAC-seq 数据集中 ECs 的不同峰值，显示 SiO₂ 处理组机械应力评分有所上升（图1 J-L ）。

分析ECs中机械应力相关基因的富集情况（图1 M），观察到中心基序包括Sox9、Stat1、Ets1、Fosl1、Fos、Etv1、Rela、Neurog1、Meis2、Pparg、Jun、Gata4、Foxp2、Nfkb1和Irf1（图1 N）。这些结果证实了ECs中异常机械敏感信号通路在职业性PF发病机制中的关键作用。

图1 单细胞多组学分析显示SiO2诱导小鼠PF模型中ECs机械应力升高。

博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化（PF）小鼠被广泛用作研究PF的动物模型。为进一步验证上述发现，采集了BLM处理小鼠的肺组织，进行单细胞多组学研究。进一步确定EC 机械敏感通路中哪一个特定基因可能促成PF的进展，数据分析确定了机械敏感的Piezo1和Piezo2可能作为参与PF发病机制的候选基因。随后分析了ECs中所有机械应力相关基因的峰值，发现ECs峰值活性增加主要包括Piezo1和Piezo2。有趣的是，在BLM处理的小鼠的ECs中，Piezo1表达有所增加，Piezo2则表现出相反的表达模式。

与上述发现一致的是，对小鼠模型进行免疫荧光分析显示，BLM处理小鼠肺内皮细胞中Piezo1表达显著上调。进一步验证了在人类样本中的发现，Piezo1主要在血管ECs中表达，而Piezo2则在淋巴ECs中优先表达。与对照组相比，IPF组中Piezo1+ 细胞显著增加，而Piezo2+ 细胞则无显著变化。使用IPF患者和正常对照进行免疫荧光验证，确认IPF血管ECs中Piezo1 表达显著上调。因此，研究人员选择了 Piezo1 作为功能验证的有力干预靶点。

接下来，使用他莫昔芬诱导的EC特异性CreERT2系统在成年小鼠血管细胞中敲除Piezo1（Piezo1ΔEC），观察到 Piezo1 在肺血管内皮细胞中显著敲低（图2 A-B）。Masson染色、PSR 染色和H&E染色显示了Piezo1ΔEC 小鼠胶原蛋白沉积和炎症的显著减少（图2 C）。α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）免疫荧光染色进一步验证了Piezo1 缺失对ECs肺纤维化的抑制作用（图2 D）。在这些Piezo1ΔEC 小鼠中使用BLM诱导肺纤维化观察到肺组织中羟脯氨酸（‌Hydroxyproline‌）显著减少（图2 E）。

给药 Piezo1 激动剂 Yoda1，发现与生理盐水对照组相比，Yoda1 的气管内和腹腔内给药均导致小鼠肺部炎症细胞和纤维化增加。应用拮抗剂和激动剂继续探讨 Piezo1 是否是 PF 的潜在治疗靶点（图2 F）。组织病理染色和羟基脯氨酸检测显示，拮抗剂 GsMTx4 减少了纤维化肺组织中羟基脯氨酸的产生以及 ECM 和胶原蛋白的沉积，表明 GsMTx4 能有效缓解 PF，而激动剂 Yoda1 则加剧了 BLM 诱导的 PF 小鼠模型中的纤维化反应（图2 G-I）。重要的是，Yoda1 在接受 BLM 处理的内皮特异性 Piezo1 敲除小鼠中未能加重纤维化，证实了 Yoda1 的促纤维化效应是通过内皮 Piezo1 介导的。

这些数据表明，在 ECs 中靶向 Piezo1 可抑制肺纤维化的发展，强调了 Piezo1 作为 PF 治疗干预开发的有前景靶点。

图 2 PIEZO1的基因缺失和药物干预影响PF的发展。

最xin研究表明，ECs通过旁分泌和近分泌两种机制在肺纤维化的发病过程中起着至关重要的作用，通过多种生物活性分子，特别是细胞因子和趋化因子的分泌介导。值得注意的是，新兴证据表明异常机械应力在病理过程中会显著影响这些介质从ECs中的释放。基于这些发现，研究人员提出了一个新假说，即异常机械应力通过调节 ECs 中促纤维化因子的分泌，促进 PF 的进展。

为进一步探索对机械应力敏感且受 Piezo1 信号调控的下游促纤维化因子，分析了 scRNA-seq 数据，显示 IGFBP5、IL33、MGP、SPRY1 和 ACKR1 在 ECs 中特异性表达，这些基因与机械应力评分表现出显著相关性。然而， Piezo1 的表达仅与 IL33 和 ACKR1 的表达呈正相关。鉴于ACKR1不被归类为细胞因子，因此选择IL33作为该研究的最终治疗靶点。IL33在ECs中特异且高度表达，IPF组IL33显著上调。snRNA-seq数据集的Violin图显示，Piezo1+ 细胞的IL33表达显著高于Piezo1- 细胞，IPF组的Piezo1+ ECs表现出高于对照组的IL33表达水平。此外，BLM处理小鼠ECs中IL33表达也上调。免疫荧光染色显示，Yoda1增强了IL-33表达，而GsMTx4则有相反效果。免疫荧光分析进一步证实，ECs中特异性缺失Piezo1显著降低IL-33表达，强化了Piezo1激活调控ECs中IL33分泌的假说。

为确定ECs中的IL33是否对PF发展至关重要，特异性删除ECs中的IL33，并应用BLM创建肺纤维化小鼠模型（图3 A），IL33的mRNA和蛋白通过Vecad-Cre/LoxP在ECs中有效删除（图3 B）。使用Masson、PSR、H&E和αSMA染色和羟脯氨酸测定法的后续分析表明，在BLM诱导的PF小鼠模型中，IL33 ΔEC 小鼠的纤维化反应明显低于IL33 WT小鼠（图3 C-E）。

进一步构建具有EC特异性IL33过表达（OE-IL33）的Piezo1 ΔEC小鼠模型，随后进行BLM处理（图3 F），IL33的mRNA和蛋白水平确认了肺组织中IL33的过表达（图3 G）。如预期，ECs中Piezo1的特异性缺失缓解了肺纤维化，但这一效应被AAV-IL33在ECs中特异性高表达所显著逆转（图3 H-J）。这些体内功能修复实验表明，内皮Piezo1的激活以IL33依赖性方式促进了PF的发展。

图3 内皮PIEZO1调控肺纤维化需要IL-33。

最后，利用原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）研究了 Piezo1 对 IL33 表达的调控机制。由于细胞张力和基质硬度变化都可激活 Piezo1 通道，因此，使用细胞拉伸装置对 HUVECs 单层施加张力，并在不同硬度的底物上培养 HUVECs，模拟 Piezo1 的自发激活。结果发现，当受 20% 应变时，HUVECs 中 IL33 的分泌和 mRNA 转录水平在6小时内最初上升，24小时后下降，同时，在 25 kPa 底物上培养的单层 HUVECs 表现出更高的 IL-33 分泌和转录表达水平（图4 A-B）。值得注意的是，在细胞接受 20% 张力6小时或在 25 kPa 底物上培养后，用 shRNA 沉默 HUVECs Piezo1 表达，抑制了 IL-33 的分泌和转录（图4 C-E）。

CAPN2 作为 Piezo1 介导机械转导通路中的关键下游效应因子，参与多种机械响应的生物过程。有趣的是，经过 20% 幅度的拉伸和 25 kPa 底物培养后，Calpain2 的活性和蛋白质水平均显著增加，趋势与 IL-33 相似（图4 F、G），这些效应被 Piezo1 敲低抑制（图4 H、I）。因此，可推测 Piezo1 激活诱导的IL33 依赖于CAPN2。与假设一致，CAPN2 敲低（shCAPN2）在机械刺激下显著降低 IL-33 的表达和分泌（图4 J、K）。

转录因子（TFs）是结合启动子区域并直接启动靶基因表达所必需的。为了探讨哪些 TFs 作为 PIEZO1-CAPN2 轴的下游分子调控 IL-33 表达（图4 L），利用了 Cistrome 公开转录因子数据库，预测了可能调控 IL33 表达的前十大转录因子（图4 M）。此外，利用纤维化小鼠模型的 scATAC-seq 数据集对 ECs 中差异峰进行了基序富集分析，并确定出内皮表达量最高的 100 个基序（图4 N）。Venn 图分析表明，STAT3 是机械力作用下调节 IL33 表达的关键 TFs（图4 N）。重要的是，6小时的机械拉伸明显促进了 STAT3 的激活，这一点通过 p-STAT3 免疫印迹法显示（图4 O），这种拉伸诱导的激活被 Piezo1 和 CAPN2 的沉默阻断（图4 P）。这些结果表明，STAT3 可能作为 Piezo1 的下游 TF，参与 IL33 表达的调控。在机械刺激条件下（循环 20% 拉伸应变和 25 kPa 底物硬度）培养的 HUVECs 中，STAT3 敲低（shSTAT3）显著减弱了 IL33 转录本水平和蛋白质分泌（图4 Q、R）。

这些数据表明，内皮 Piezo1 的激活诱导下游前纤维化分子 IL-33 调控 PF 的发展，可能通过 CAPN2-STAT3 轴。

图4 CAPN2-STAT3轴调节PIEZO1激活时IL-33的表达。

总之，通过在 BLM/SiO₂ 诱导小鼠模型中进行跨物种验证和 scRNA-seq 确认，该研究确立了内皮PIEZO1作为纤维化重塑中中枢机械转导蛋白的地位。机制研究显示，PIEZO1 介导的钙通量激活 CAPN2 依赖的 STAT3 磷酸化，可能触发 IL-33 分泌，通过旁分泌信号维持成纤维细胞激活。这些结果使内皮 PIEZO1-CAPN2-STAT3-IL33 轴成为具有治疗PF潜力的机化学信号。

但该研究也缺乏关于 ECs 与其他细胞之间细胞串扰的研究。IL-33，一种 EC 衍生的坏死因子，可能在 PF 发育过程中激活血管周围成纤维细胞和巨噬细胞，因此需要进行共培养实验来探讨此事。尽管仍需更多研究，该研究工作仍然阐明了 ECs 中异常机械应力的分子和细胞节点，有望助力发现治疗纤维化疾病的新候选疗法。

参考文献：Zhang L, Gui X, Hou R, Jia L, Xia S, Zhang X, Fu Y, Meng QF, Luo Q, Shi X, Guo B, Liang R, Yue L, Chen X, Xu H, Wang P, Tong X, Liu L, Wang L, Li B, Chen Z, Zhou L, Zhang L, Chen R, Sun C, Xu W, Rao L, Zhou H, Ding BS, Chen S. Single-cell multiomics uncovers an endothelial mechanosensitive PIEZO1-IL-33 axis driving pulmonary fibrosis. Nat Commun. 2026 Mar 20;17(1):2655. doi: 10.1038/s41467-026-70193-w. PMID: 41862476; PMCID: PMC13004862.

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